ELISA仅能检测可溶性目标蛋白，所有沉淀（如细胞碎片、血小板、纤维蛋白凝块、组织残渣、细菌或脂质微粒）均含干扰物质——例如红细胞释放的过氧化物酶（HRP）会与TMB底物非特异反应；白细胞层中的内源性酶或高血脂颗粒会遮蔽抗原表位或增强本底。因此，离心不仅是分离步骤，更是质量控制的关键环节。
分样本类型：沉淀成因与对应处理方式
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样本类型 |
沉淀常见成分 |
是否允许保留沉淀 |
推荐二次处理方式 |
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血清 |
纤维蛋白凝块、少量白细胞/血小板残留 |
❌ 严禁保留 |
4℃, 3000g再离心20 min；或0.22 μm滤膜过滤 |
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EDTA/肝素血浆 |
血小板聚集体、微凝块（抗凝不全时） |
❌ 严禁保留 |
4℃, 3000g二次离心10 min；若仍有悬浮颗粒，建议过滤 |
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细胞培养上清 |
脱落贴壁细胞、死细胞碎片、细胞外囊泡聚集体 |
❌必须去除 |
4℃, 3000g离心10 min→取上清；必要时加10,000g超速离心10 min去囊泡 |
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组织匀浆液 |
未破碎组织残渣、核碎片、线粒体、脂滴（尤其肝/肾/脂肪组织） |
❌上清必须无色透明 |
首次5000g离心5 min→取上清；再10,000g离心10 min→取上清；脂肪组织需额外弃去乳白色上层 |
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尿液/脑脊液/肺泡灌洗液 |
黏蛋白、脱落上皮细胞、细菌、灌洗残留红细胞 |
❌必须去除 |
4℃, 1500–3000g离心10–15 min；若仍有细小颗粒，0.22μm滤膜过滤 |
所有二次离心均需在4℃预冷离心机中进行，防止蛋白变性或酶活下降；
过滤推荐使用低蛋白吸附的PVDF或尼龙滤膜（0.22μm），避免目标蛋白被吸附损失；
若沉淀为脂质层（乳白色）（如高脂血清、脂肪组织匀浆），不可简单吸取中层——应先离心去脂，再取下层澄清液；
溶血样本（红色血清）必须废弃，因其释放的血红蛋白和过氧化物酶会严重干扰HRP标记体系。
操作避坑指南（高频错误汇总）
❌“轻轻吸取上清”≠“避开中间白层即可”：白细胞/血小板层（灰白带）下方常混有微小凝块，务必以慢速、低吸头角度、悬空吸取，避免触碰任何界面；
❌离心转速/时间不足：如血清仅用1000×g离心10 min，无法沉降微小纤维蛋白，易致后续孔板显色不均；
❌室温离心血浆：温度过高易激活凝血因子，诱发微凝集，必须全程2–8℃冷链操作；
❌反复冻融后直接上样：冻融会释放胞内酶和核酸，形成黏稠沉淀，必须再次离心（10,000g, 10 min）去除；
❌忽略试剂盒特殊要求：部分检测（如补体C3/C4）要求去除所有补体激活产物，需用EDTA血浆+立即冰浴离心，禁用肝素。
沉淀不是终点，而是质量控制的起点。最稳妥的做法是：将“离心后肉眼检查上清澄清度”列为SOP强制步骤，并建立《沉淀异常登记表》（含样本编号、沉淀形态、处置方式、复测OD值），便于快速定位系统性问题。